高速冷凍研磨均質(zhì)儀對(duì)動(dòng)物組織之雞內(nèi)臟研磨實(shí)案例分享

　　使用高速冷凍研磨均質(zhì)儀研磨雞內(nèi)臟，后續(xù)建庫(kù)做HI-C實(shí)驗(yàn)。由于HI-C 實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本完整性和染色質(zhì)構(gòu)象的要求嚴(yán)苛，尤其是雞內(nèi)臟(如肝臟、腎臟)這類富含酶類和結(jié)締組織的樣本，全程低溫保護(hù)與徹底均質(zhì)化是下游建庫(kù)成功的關(guān)鍵。我們通過(guò)凈信高速冷凍研磨儀(JXFSTPRP-192CL)處理雞肝臟樣本，成功解決了 “低溫維持難”“組織堅(jiān)硬磨不碎” 兩大痛點(diǎn)，為 HI-C 實(shí)驗(yàn)提供了高質(zhì)量的起始材料。

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　　高速冷凍研磨均質(zhì)儀 JXFSTPRP-192CL

　　實(shí)驗(yàn)背景：雞內(nèi)臟樣本的兩大挑戰(zhàn)

　　HI-C 實(shí)驗(yàn)需要保留染色質(zhì)的空間構(gòu)象，任何溫度波動(dòng)或機(jī)械損傷都可能導(dǎo)致 DNA 斷裂、交聯(lián)失效，最終影響互作信號(hào)的準(zhǔn)確性。而雞肝臟組織存在兩個(gè)顯著難點(diǎn)：

　　低溫敏感：樣本中含大量?jī)?nèi)源性核酸酶和蛋白酶，常溫下 10 分鐘即可引發(fā)染色質(zhì)降解，必須全程維持 - 20℃以下環(huán)境;

　　質(zhì)地堅(jiān)硬：雞肝臟雖為軟組織，但富含結(jié)締組織和血管，傳統(tǒng)研磨易出現(xiàn) “塊狀殘留”，導(dǎo)致細(xì)胞破碎不完全，交聯(lián)效率差異大。

　　前期兩次手工研磨嘗試均失敗：第一次因液氮揮發(fā)后溫度回升，樣本解凍后染色質(zhì)降解，建庫(kù)后測(cè)序數(shù)據(jù)中 “無(wú)效互作” 占比超 40%;第二次雖全程補(bǔ)加液氮，但手工研磨不徹底，鏡檢發(fā)現(xiàn) 30% 的組織塊未破碎，最終文庫(kù)復(fù)雜度不足，實(shí)驗(yàn)被迫中止。

　　解決方案：高速冷凍研磨均質(zhì)儀的 “低溫 + 高頻” 協(xié)同策略

　　針對(duì)雞內(nèi)臟樣本特性，我們采用凈信高速冷凍研磨均質(zhì)儀，通過(guò)以下參數(shù)設(shè)置實(shí)現(xiàn)突破：

　　全程超低溫鎖鮮，阻斷酶活性，高頻振動(dòng)破碎，實(shí)現(xiàn)均質(zhì)化

　　第一組測(cè)試參數(shù)提前將樣品放入液氮里面冷凍10分鐘，再放入2 mL離心管里，放了一顆3mm的珠子，一顆2mm的珠子，后用65HZ,研磨兩分鐘。沒(méi)有研磨粉碎，樣品太堅(jiān)硬了。

　　第二組測(cè)試參數(shù) 用了5ml的研磨管，放了5mm的研磨珠兩顆，3mm研磨珠一顆，樣品還是從度-80度冰箱拿出后放入液氮里面浸泡10分鐘后，調(diào)65HZ,研磨一分鐘后，出來(lái)效果很好，是粉末狀。

　　操作總結(jié)：第二次的研磨設(shè)置達(dá)到了研磨要求，當(dāng)樣品粉碎不徹底的情況下，可以更換一下大號(hào)珠子重新進(jìn)行研磨。

　　實(shí)驗(yàn)效果：

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　　樣品研磨前后效果對(duì)比圖

　　關(guān)鍵操作要點(diǎn)與注意事項(xiàng)

　　1、研磨管對(duì)稱裝載：因儀器高頻振動(dòng)，需在相對(duì)位置放置重量一致的平衡管(含等量緩沖液 + 研磨珠)，避免儀器偏移導(dǎo)致的溫度波動(dòng);

　　2、研磨珠選擇：雞內(nèi)臟組織建議用 “3mm 鋼珠 + 1 顆 5mm 鋼珠” 組合，兼顧破碎效率與樣本接觸面積;

　　3、防污染處理：每批次實(shí)驗(yàn)后，研磨倉(cāng)用 75% 酒精擦拭，研磨管和鋼珠經(jīng) 121℃高壓滅菌 30 分鐘，避免交叉污染(尤其處理不同雞個(gè)體樣本時(shí))。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：高速冷凍研磨均質(zhì)儀通過(guò) “超低溫環(huán)境 + 高頻振動(dòng)”的協(xié)同作用，完美解決了雞內(nèi)臟樣本在 HI-C 實(shí)驗(yàn)中的兩大痛點(diǎn)：既通過(guò)全程低溫阻斷了染色質(zhì)降解，又通過(guò)高效破碎確保了細(xì)胞均一性。相比傳統(tǒng)方法，該方案使樣本處理時(shí)間大大縮短，實(shí)驗(yàn)成功率從50%提升至 100%，為動(dòng)物內(nèi)臟組織的 HI-C、ATAC-seq 等對(duì) “染色質(zhì)完整性” 敏感的實(shí)驗(yàn)提供了可靠的前處理方案。后續(xù)嘗試處理雞腎臟、脾臟等樣本，均獲得類似效果，證明該方法對(duì)禽類內(nèi)臟組織具有普適性。

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